紅細胞壽命測定與血液病的精準診斷
發(fā)布時間：2017-02-04 17:13 作者：無 點擊：
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精準醫(yī)療的目的是精準治療，精準治療的前提是針對分子靶點的精確診斷分型。目前國際上白血病診斷通用的是細胞形態(tài)學（Morphology）、免疫學（Immunology）、細胞遺傳學（Cytogenetics）和分子生物學（Molecular biology）分型，即我們常說的MICM分型方法。
隨著分子診斷技術的日益發(fā)展和白血病分子標志物被發(fā)現(xiàn)，各種先進的分子診斷技術已應用于白血病診斷領域，白血病的診斷已從過去以形態(tài)為主的診斷體系，正逐步向以精確分子診斷為核心的個體化診斷體系發(fā)展。隨著細胞遺傳學、流式細胞術免疫表型分析和第2代測序技術等新的診斷技術在臨床的推廣應用，血液病進入一個精確診斷時代。這些技術在白血病的診斷、微小殘留病的監(jiān)測、預后判斷及靶向治療等方面發(fā)揮了重要的作用，有些已成為臨床必需的常規(guī)檢測項目。正確解讀這些新興的診斷技術及方法，可指導臨床醫(yī)生合理、優(yōu)化及針對患者量身定做找到每一個白血病發(fā)病原因及治療方法。
先亞生物科技研發(fā)的紅細胞壽命測定儀檢測的原理
應用放射性核素在體內(nèi)或體外標記紅細胞，并觀察這些標記的紅細胞中的放射性消失的速率，從而獲得紅細胞每天死亡的百分數(shù)或稱紅細胞更新的查分數(shù)，則100%更新所需的時間為紅細胞壽命期，另外也可利用放射性核素參加紅細胞生成，測定放射性在紅細胞中消失時間，而求得紅細胞壽命。目前常用的示蹤劑為51鉻酸鈉及氟32磷酸二異丙酯：用放射性鐵測定紅細胞壽命，正常人紅細胞壽命為100～130天，平均125天左右，此外應用51鉻標記紅細胞在循環(huán)血液中減少50%，即T50半衰期作為臨床指標，此法較簡便，正常人為25～40天，20天以下為縮短，17天以下為明顯縮短，溶血性貧血患者紅細胞壽命明顯縮短，如鐮狀紅細胞性貧血縮短至5～15天，陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）縮短至10天左右。本試驗對研究和診斷溶血性貧血是一個重要方法，通過分析紅細胞壽命縮短的原因，可確認是由于紅細胞自身缺陷而致紅細胞壽命縮短，還是由于患者體內(nèi)某些外界因素而致細胞壽命縮短，而患者本身紅細胞是正常的。真性紅細胞增多癥紅細胞壽命延長。
一、 細胞與分子遺傳學檢測
1. 熒光原位雜交（fluorescece in situ hybridization，F(xiàn)ISH）：是臨床上的常規(guī)檢測方法,是檢測融合基因的金標準方法。比常規(guī)的染色體核型分析要方便、準確和快速，它可檢出一些常規(guī)染色體核型分析不易發(fā)現(xiàn)或有不明來源的標志染色體。可檢測平衡易位和微缺失；用于快速診斷、分類、治療。
2. 多色熒光原位雜交（multiplex-FISH,M-FISH）,多用以確定微小的染色體易位、來源不明的標記染色體和隱匿的染色體異位。其獨特的優(yōu)勢在于可一次性分辨全部人類染色體，適用于復雜異常核型的診斷、風險分類和預后判斷，主要用于初發(fā)和復發(fā)病例的檢測。但其無法檢測同一條染色體中的易位或倒位、小片段缺失和重復等異常，也不能精確地顯示染色體斷裂的區(qū)帶，且靈敏度不及PCR，因此具有一定的局限性。另外，由于費用昂貴，目前尚未普及開展。
3. 微陣列比較基因組雜交（array comparative genomic hybridization，aCGH）。在全基因組水平上檢測白血病基因組DNA序列的拷貝數(shù)變異。有較高的分辨率，可找到染色體核型分析難以發(fā)現(xiàn)的不同染色體上可能的斷裂點和具體的位點。在鑒定慢性淋巴細胞白血?。–LL）患者微小基因片段重復或丟失的染色體異常，也可用于與治療相關AML患者的基因分層。還可以發(fā)現(xiàn)因藥物治療相關的白血病而導致一些重要微小染色體區(qū)域的異常。因其不能檢測出平衡易位，且對于異常細胞比例少或有丟失片段方面存在漏檢。目前CGH和 aCGH 尚未成為臨床應用的常規(guī)檢查之一。
4. SNP芯片：具有高通量性特點，在鑒別白血病是否發(fā)生復發(fā)突變或克隆演變方面具有較好的臨床價值；在全基因組水平檢測與白血病發(fā)生發(fā)展、療效和預后相關的SNP位點。目前，已有商業(yè)化SNP芯片供應，隨著技術成熟和檢測成本下降，SNP芯片將會成為篩查常規(guī)項目。
二、 微小殘留白血病檢測
微小殘留白血?。╩inimal residualdisease，MRD）是白血病復發(fā)的根源，首選檢測標本為骨髓，其次為外周血。目前已用于檢測MDR的技術主要有流式細胞術（FCM）和PCR技術，PCR技術是比FCM方法更敏感地檢出MDR，敏感性都可達到10-5~10-3（即105~103細胞中有1個腫瘤細胞）以上。
1. 多重RT-n-PCR和多重熒光PCR方法：PCR是檢測染色體易位的首選方法。二者是臨床上常用的融合基因定性檢測方法?？赏瑫r檢測已知的多種融合基因及剪切體。臨床醫(yī)生可選擇AML 16種常見融合基因、ALL 15種常見融合基因或白血病31種融合基因等組合篩查融合基因。而后者可在熒光定量PCR儀上直接判讀結(jié)結(jié)果。 目前該技術已逐漸被逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR所取代。
2. 逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR （reverse-tranion quantitative real-time PCR，RT-qPCR）：目前已作為檢測融合基因的常規(guī)方法。基于TaqMan 探針原理的RT-qPCR是目前最為理想的MRD 定量檢測方法。具有敏感度高、準確定量、簡便快速，污染較少等優(yōu)點?？捎糜诎籽〉脑\斷、分型、ＭＲＤ監(jiān)測和預后判斷。且已有商業(yè)化的試劑盒可利用。有資質(zhì)的醫(yī)療單位或?qū)嶒炇叶寄荛_展此項目。
3. 數(shù)字PCR：是基于單分子PCR方法的核酸靶分子定量檢測手段，具有高靈敏度的特點。但檢測成本高，目前還不適合于臨床常規(guī)推廣。
三、 基因突變檢測
50%以上的白血病缺乏特征性的細胞遺傳學變化，而是是多種基因突變積累的結(jié)果。目前基因突變已作為白血病的更精確地診斷分型、危險分層，個體化治療、靶向治療及評估預后轉(zhuǎn)歸的主要分子標志。例如WHO分類已將AML伴CEBPA突變和AML伴NPM1突變作為一種AML的特殊亞型。白血病較常見突變基因有JAK2、MPL、NPM1、CEBPA、FLT3、C-KIT、N-RAS、WT1、HOX11、ASXL1、DNMT3A、MLL、IDN1、IDH2和TET2等。因此高效、精準的基因突變篩查方法至關重要。
1. 直接測序法（Sanger法）：是基因測序的金標準方法，可分析未知突變。單向測序讀長達500～1000bp, 但只能測定２０％以上的突變。由于通量小，速度慢，已逐漸被其他高靈敏方法所替代或并用。
2. 焦磷酸測序（Pyrosequencing）：適于已知的短序列的測序分析，具有可重復性、快速，能檢測低至５％的突變及報告突變頻率。精確性與Sanger相似，適用已知突變位點檢測，用于白血病的分類和MRD監(jiān)測。
3. 高通量測序又名下一代測序（Next Generation Sequencing，NGS）：是現(xiàn)今應用最廣泛的高通量測序技術，是大規(guī)模平行測序。具有極高靈敏性，可在一個測試反應中檢測點突變、缺失、插入、染色體平衡易位及鑒定白血病特異的融合基因等多種異常。其檢測結(jié)果可以對臨床醫(yī)生治療方案的制定、患者預后的評估提供精準、有效的信息?？捎糜诨谕蛔儥z測的MRD分析;也可用于部分白血病發(fā)病機制的研究。由于費用問題，在臨床上尚未大規(guī)模開展?；诖髷?shù)據(jù)平臺的測序結(jié)果解讀、注釋的合作，可獲得“1+1>2”的成果。隨著檢測成本的降低，將會在臨床推廣。
四、 基因表達譜檢測
基因表達譜（gene expression profiling，GEF）：cDNA芯片具有集傳統(tǒng)細胞遺傳學、點突變分析、基因表達分析于一身的功能，已經(jīng)用于白血病GEF分析。其優(yōu)越性為能夠在基因表達水平上對白血病進行更精確的分型分類，從而提高治療的針對性。預測白血病的治療效果和預后，在探索白血病的病因和機制診斷、功能相關基因、新的治療靶基因等方面發(fā)揮重要的作用。不過，敏感度和特異度差，限制其臨床應用。
精準醫(yī)療呼喚著與此相適應的精準診斷，臨床醫(yī)生根據(jù)患者病情，正確評估形態(tài)學、免疫、細胞遺傳學及分子生物學的作用；合理檢查、精準診斷及分型、個體化治療、正確評估預后及風險分層，做使患者從精準醫(yī)療中獲得更多好處。
